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2020-10
下呼吸道感染是臨床最常見(jiàn)的感染性疾病之一， 具有很高的病死率。根據(jù)世界衛(wèi)生組織 （ＷＨＯ）2018年公布的2016年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球前十位死亡原因中下呼吸道感染高居第四位，在傳染性疾病中位列第一，共導(dǎo)致約300萬(wàn)人死亡。
2002年非典型肺炎（SARS），2003年新型H1N1甲型流感，2013年H7N9流感病毒，以及2019年新型冠狀病毒（2019-nCoV）疫情爆發(fā)，對(duì)人類(lèi)的生命健康造成嚴(yán)重威脅。可見(jiàn)，呼吸道感染對(duì)人類(lèi)健康的威脅有不斷增加的趨勢(shì)。
呼吸道感染病原早期診斷對(duì)于迅速有效控制急性呼吸道感染發(fā)揮著至關(guān)重要作用！
由于各種呼吸道病毒感染的臨床癥狀相似，醫(yī)生難以簡(jiǎn)單地通過(guò)體征做出病原學(xué)診斷。
為了及時(shí)控制病情，臨床上常常采取經(jīng)驗(yàn)性用藥，待得到培養(yǎng)結(jié)果及藥敏測(cè)試結(jié)果后再進(jìn)行調(diào)整。但這也容易導(dǎo)致抗菌藥物使用不當(dāng)，使病原微生物耐藥性出現(xiàn)及蔓延的概率增加，導(dǎo)致下呼吸道感染的診斷和治療更為棘手，成為當(dāng)今全球共同面臨的重大衛(wèi)生挑戰(zhàn)。因此，開(kāi)發(fā)新的、更準(zhǔn)確及高通量的下呼吸道感染病原微生物檢測(cè)方法具有重要意義。
近些年來(lái)，出現(xiàn)了改良細(xì)胞培養(yǎng)法分離并鑒定病毒，使其滿足臨床診斷的要求。不同的細(xì)胞種類(lèi)對(duì)病毒敏感程度不同，接種未知標(biāo)本就要選用多種不同的細(xì)胞系，工作量大，不利于臨床實(shí)驗(yàn)室操作。因此出現(xiàn)了將不同種類(lèi)的細(xì)胞混合起來(lái)制備成單層細(xì)胞的方法，可提高檢測(cè)靈敏度。R-Mix是水貂肺細(xì)胞和A549的混合細(xì)胞，用來(lái)檢測(cè)呼吸道合胞病毒（RSV）、副流感病毒（PIV）、流感病毒及腺病毒（ADV）。而隨著病毒特異性單克隆抗體的出現(xiàn)，可在產(chǎn)生CPE之前對(duì)病毒進(jìn)行鑒定，縮短病毒檢測(cè)的時(shí)間。這些方法雖經(jīng)改良，但細(xì)胞培養(yǎng)操作耗時(shí)、敏感性低、技術(shù)要求高的問(wèn)題未得到根本解決，因此在國(guó)內(nèi)仍未能得到廣泛應(yīng)用。
直接免疫熒光法是目前臨床最為常用的快速診斷方法之一。該方法使用熒光素標(biāo)記的抗病毒單克隆抗體檢測(cè)呼吸道上皮細(xì)胞中的病毒抗原，大約2h就能判斷結(jié)果。但該方法的檢測(cè)結(jié)果受樣本的質(zhì)量和處理過(guò)程影響較大，要求標(biāo)本中有一定量的呼吸道上皮細(xì)胞，否則會(huì)造成假陰性的結(jié)果。
膠體金免疫層析法利用免疫層析的原理，通過(guò)抗原抗體結(jié)合，以膠體金為示蹤物呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，從而判斷樣本中是否存在檢測(cè)的抗原或抗體。該檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、方便快捷（一般能在10～30min獲得結(jié)果）且不需要特殊設(shè)備和儀器等優(yōu)點(diǎn)，因而非常適合臨床早期診斷和出入境等機(jī)構(gòu)的現(xiàn)場(chǎng)篩查，但是其敏感性低于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Realtime RT-PCR），該檢測(cè)方法的結(jié)果僅能作為初步參考。
呼吸道病毒感染是臨床最常見(jiàn)的疾病之 一，病原學(xué)復(fù)雜，準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷是合理選擇治療方案的基礎(chǔ)。
核酸檢測(cè)法是檢測(cè)病毒保守特異的核酸序列，可將病毒鑒定到種。臨床實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用最廣泛的是PCR技術(shù)，利用互補(bǔ)引物特異性指數(shù)擴(kuò)增病毒基因組中的片段。基于PCR技術(shù)及其衍生的熒光PCR和多重PCR技術(shù)，對(duì)病毒核酸檢測(cè)靈敏度和特異性均較高（比傳統(tǒng)病毒培養(yǎng)方法敏感3.8倍左右），但實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，單次檢測(cè)種類(lèi)有限，且成本較高。另外，有些病毒一旦感染后就會(huì)永久寄生在宿主體內(nèi)，病毒核酸檢測(cè)過(guò)于敏感，即使擴(kuò)增結(jié)果陽(yáng)性未必代表患者處在某種病毒的急性感染期。
病原微生物宏基因組檢測(cè)法（mNGS）
宏基因組學(xué)（Metagenomics）也叫微生物環(huán)境基因組學(xué)。通過(guò)直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA,構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，利用基因組學(xué)的研究策略研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。它是在微生物基因組學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種研究微生物多樣性、開(kāi)發(fā)新的生理活性物質(zhì)（或獲得新基因）的新理念和新方法。
宏基因組二代測(cè)序，英文為“Metagenomics Next Generation Sequencing”,即mNGS，利用高通量測(cè)序，對(duì)樣本中的核酸進(jìn)行測(cè)序，可一次并行獲取標(biāo)本中的人源核酸序列信息和外源病原微生物核酸序列信息，將獲得的序列與人類(lèi)基因組序列庫(kù)和病原體微生物基因組序列庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋?zhuān)纯蓪?shí)現(xiàn)病原微生物的鑒定。
宏基因組檢測(cè)覆蓋已知的所有病原，對(duì)感染標(biāo)本直接進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需預(yù)設(shè)，直接檢測(cè)。包括細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)，以及支原體等，都可以“一網(wǎng)打盡”，為臨床中呼吸道感染提供快速精準(zhǔn)診斷依據(jù)。
宏基因組測(cè)序和傳統(tǒng)檢測(cè)方法學(xué)在病原檢測(cè)方面的時(shí)效性比較示意圖：
（病毒在多種方法學(xué)中的檢測(cè)中時(shí)效性的對(duì)比）
膠體金免疫層析法：第3-7天；流式細(xì)胞法：第1-10天；傳統(tǒng)免疫熒光法：第1-10天；核酸檢測(cè)法：第0.5-20天；血清IgM：第5天后；IgG檢測(cè)法：第15天后；mNGS法：1-2天。
總結(jié)：
通過(guò)分析比較，傳統(tǒng)的培養(yǎng)法雖然是檢測(cè)下呼吸道感染病原體的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但通常需要2-4ｄ甚至更長(zhǎng)時(shí)間?？乖椒z測(cè)結(jié)果對(duì)樣本的質(zhì)量要求高，否則容易造成假陰性的結(jié)果。血清學(xué)方法存在通量低，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果等缺陷。核酸檢測(cè)方法雖然是目前最快速的選擇，但其單次檢測(cè)種類(lèi)有限。目前宏基因組病原體檢測(cè)優(yōu)勢(shì)明顯，具有快速檢測(cè)、全面覆蓋、準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢(shì)，適合于呼吸道感染的各個(gè)階段，尤其是對(duì)早期診斷意義重大，已經(jīng)逐步成為病毒診斷技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。
呼吸道感染臨床早期診斷有利于避免抗生素的濫用，根據(jù)病原體的不同正確地進(jìn)行抗病毒治療；有利于降低院內(nèi)傳播風(fēng)險(xiǎn)；有利于開(kāi)展個(gè)體化診療以降低患者整體治療費(fèi)用；并為早期預(yù)防和治療提供病原學(xué)的有力支撐和實(shí)驗(yàn)室的明確診斷。
參考文獻(xiàn)：
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